Här kommer en relativt lång utläggning om min senaste spännande laboration om kroppens immunförsvar. Immunförsvaret är så häftigt, ett komplicerat system utvecklat för att vi ska kunna hålla oss så friska som möjligt. Det är verkligen ett område som intresserar mej :) Ingen ny forskning, men mycket fakta om immunförsvaret och en del tankar kring det här med att labba medicinskt.
I denna labben så vill vi studera hur det specifika immunförsvaret reagerar på patogener, och kommer rikta in oss på att studera T-hjälparceller, en typ av vita blodkroppar som står för kroppens försvar. Dessa hjälper immunförsvaret att reagera på olika sätt genom att utsöndra signalsubstanser kallade cytokiner.
T-hjälparcellerna delas in i två grupper, T-hjälparceller typ 1 och T-hjälparceller typ 2. För enkelhetens skull förkortar vi dessa till Th1 och Th2. Denna indelning beror på att det finns en varians i vilken typ av cytokiner som utsöndras.
Th1: Th1 utsöndrar cytokiner vid infektion orsakad av mikroorganismer som gömmer sig i kroppens celler. Det kan vara virus och vissa typer av bakterier. Fagocyterande celler (celler som ”äter upp” patogenen) samt cytotoxiska celler (celler som får en invaderad cell att gå in i självdöd) är de främsta celler som aktiveras av Th1’s cytokiner.
Den Th1-cytokin som vi i vår lab tittar på är IFN-gamma (interferon-gamma). Denna fungerar alltså som en markör för aktiviteten hos Th1-cellerna.
Th2: Th2’s cytokiner utsöndras vid infektion med patogener utanför kroppens celler som leder till antikroppsproduktion, (Antikroppar är receptorer, d.v.s. proteiner på cellytan som binder till sådant som tillhör främmande ämnen för att fångas upp och vidare elimineras från kroppen), samt aktivering av eosinofila granulocyter (celler som utsöndrar toxisk substans för patogener för stora för att ”ätas upp”, så de dör), och mastceller (binder antikroppar som i sin tur aktiverar utsöndring av olika typer av inflammatoriska substanser, så som den inom allergi kända substansen histamin).
Den Th2- cytokin vi använder i labben är IL-4 (Interleukin-4). Denna cytokin fungerar istället som markör för andelen aktiverade Th2-celler vid infektion.
Hur väl rätt typ av immunförsvar (Th1 respektive Th2) utvecklas vid infektion är vid många olika sjukdomar avgörande för om man som individ blir sjuk eller inte, d.v.s. om T-hjälparcellerna skapar den mängd rätt cytokiner för att aktivera tillräckligt med motståndskraft mot patogenen.
I labben använder vi oss av en metod kallad ELISPOT (Enzyme Linked Immunospot). Genom denna teknik får man cytokinerna som utsöndras av Th-cellerna att färgas in. Varje utsöndrande cell motsvarar sedan en prick (en spot) i provet som vid laborationens slutfas räknas för hand i mikroskop.
Hur processen går till:
Det som är spännande när man ska studera något som sker i kroppen, utanför kroppen (detta kallas för in vitro-studie medan det som faktiskt sker i kroppen kallas för in vivo), är att man måste anpassa hela förloppet man vill studera så att man genom blotta ögat eller olika mätinstrument får ett synligt resultat.
Det är också detta som kan komplicera processen då man behöver hålla isär de involverande bitar som tillhör den verkliga biologiska processen och de som lagts till för att vi ska kunna studera denna process.
Självklart blir detta mycket mer förståeligt med bilder. Som Einstein en gång sade: ”Kan man inte förklara det enkelt kan man det inte tillräckligt bra”.
Så hur går det då till när vi vill stimulera dessa immunoceller och dess utsöndring av cytokiner?
Jo, först och främst behöver man något underlag att placera alla sina legobitar på. Vi använder en mikrotiterplatta, en platta i plast med små brunnar i. Till varje brunn läggs ett nitrocellulosamembran. På ett sådant membran kan antikroppar, dit cytokiner kan binda in, fästa. Just för att antikropparna binder in till vår ”coating” (membran) kallas dessa för coatningsantikroppar.
Det finns alltså en specifik antikropp för Th1´s cytokin IFN-gamma, och en för Th2’s IL-4.
Det vi nu gjort är att skapa ”låtsas-immunoceller” mottagliga för Th1- respektive Th2-cytokiner.
Nu måste vi trigga våra T-hjälparceller att utsöndra cytokiner som kan binda in till dessa antikroppar.
Vi triggar igång dem med influensavirus respektive stelkrampsbakterier. Influensavirus tränger in i kroppens celler och varnas alltså genom cytokiner från Th1.
Stelkrampsbakterier tränger inte in i kroppens celler utan befinner sig utanför dem. De utsöndrar ett toxin vid namn tetanus toxoid, och det är detta toxiska ämne som Th2 kommer stimuleras av för cytokinutsöndring/”varning”.
När vi nu aktiverat våra T-hjälparceller, och dess cytokiner binder in till våra coatingsantikroppar är vi ju egentligen biologiskt sett klara. Kruxet är att vi inte har något synligt att mäta på. Därför kommer vi tillsätta ytterligare en antikropp (som biologiskt sett inte har med det hela att göra utan funkar som en ”lampa” för oss på lab). Denna antikropp får det passande namnet detektionsantikropp just för att den kommer detektera det vi vill studera.
Nu är det många pusselbitar som ska falla på plats så det gäller att hänga med. Detektionsantikroppen har förmågan att binda ett enzym. Ett enzym är ett protein som skyndar på en reaktion av något slag. Vårt enzym, som kallas Alkaliskt fosfatas AP, står för påskyndade av en reaktion som kommer bilda en synlig fällning. Vi återkommer till den.
För att AP-enzymet ska binda in till detektionsantikroppen kan vi maximera inbindningen genom en liten molekyl biotin samt ett protein kallat streptavidin. Genom att biotinet binder in till detektionsantikroppen kan streptavidinet binda in, och detta protein kommer sist men inte minst binda in enzymet AP. Puh!
Trots alla tillsatser har vi ännu inte kommit till vår reaktion som ger oss våra synliga spots. Därför tillsätter vi nu två ämnen, låt oss kalla dem för A och B, som när de träffar på det inbundna enzymet börjar reagera med varandra. A och B kommer bilda den synliga fällning som jag tidigare pratade om. En fällning är en olöslig färgad produkt.
I och med detta har vi slutfört processen.
Nu är det bara att tolka resultatet och se om det stämmer överens med sin hypotes, det resultat man innan genomförandet trott att man ska få.
Resultat:
Vi fick en markant förhöjd koncentration IFN-gamma vid influensavirus-stimuli, precis som beräknat.
Vi fick dock en högre koncentration IFN-gamma än IL-4 vid stelkrampsbakterie-stimuli även om IL-4-koncentrationen var högre än när cellerna inte var stimulerade alls. Detta är inte enligt vår hypotes då IL-4 är den koncentration som ska dominera vid stelkrampsbakterie-stimuli.
Slutsats: Att det inte går som man alltid räknat på lab är inget ovanligt. Många steg ska gå rätt samtidigt som den biologiska process man studerar görs i en miljö som den annars inte skulle ske i (vi kommer tillbaka till in vitro kontra in vivo- utan- respektive innanför kroppen).
Den största risken för att smutsa ner sina prover (kontaminera som det finare heter på ”labspråk”) är utföraren själv. Vi bär på massa patogener och andra biologiska substanser som kan förändra våra resultat.
Som slutkläm kan nämnas att flera försök måste göras tills man kan säga att man har ett trovärdigt resultat, uppvisa signifikans som det kallas.
Ibland kan teorier som man länge trott på förkastas genom att den nya data man fått fram uppvisar tillräckligt hög trovärdighet för att förkasta den gamla.
Ibland görs försök där man har en klar bild av vad man borde få för resultat, och så visar det sig att teorin var felaktig. För en medicinsk forskare som kanske vigt många år till att påvisa sin hypotes kan detta lätt ses som ett stort misslyckande. Men man ska inte alltid se negativa resultat som just negativa. Att påvisa att en viss teori inte stämmer kan vara lika värdefull fakta. Frågor som varför det inte blir så som man logiskt tänker är superviktiga att få svar på. Något kan vara självklart i teorin men se helt annorlunda ut i praktiken.
